کلون سازی، تعیین توالی و بیان ژن آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی

2 بخش ژنومیکس و مهندسی ژنتیک، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج

چکیده

سابقه و هدف: آنزیم L - آسپاراژیناز داروی موثر در درمان لوکمی لنفوبلاستیک و لنفومای غیرهوچکینی است. مهم‌ترین باکتری‌های مولد این آنزیم باکتری‌های اشریشیا کلی و گونه‌های مختلف اروینیا به‌ویژه اروینیا کریزانتمی می‌باشند.هدف از این پژوهش، ارزیابی آنزیم L-آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی DSM 4610 بود. مواد و روش‌ها: در ابتدا DNA ژنومی باکتری استخراج و پس از طراحی پرایمرهای اختصاصی Echr Asn F و Echr Asn R1 آزمون PCR انجام شد.در مرحله بعد، این ژن درون وکتورpTZ57R/T  الحاق و به درون سلول میزبان اشریشا کلی DH5α وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب استخراج گردیدند. پس از تعیین توالی، نتایج توسط نرم افزارDNAMAN مورد بررسی قرار گرفت. با طراحی پرایمرهای بیانی، همسانه سازی در ناقل pAED4 انجام شد و پس از تراریخت نمودن سلول‌های اشریشیا کلی BL21(DE3) بیان پروتئین با روش SDS-PAGE ارزیابی شد. یافته‌ها: ژن جدا شده از سویه اروینیا کریزانتمی DSM4610 تفاوت‌های مشخصی با سایر ژن‌های مربوط به این آنزیم در بانک ژن داشت و با شماره دسترسی JF972567 در بانک ژن ثبت شد. بیشترین میزان بیان پروتئین پس از فرآیند بهینه‌سازی در شرایط. غلظت نیم میلی‌مولار IPTG ، محیط کشت LB Broth و دمای 37 درجه سانتی‌گراد حاصل گردید. الکتروفورز پروتئین روی ژل SDS-PAGE ، پروتئینی به وزن مولکولی تقریبا 5/37 کیلودالتون را نشان داد . نتیجه‌گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که آنزیم L-آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی، شرایط مناسب برای مطالعات بیشتر به عنوان یک آنزیم ضدلوکمی را دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1. Kotzia GA, Labrou NE. L-Asparaginase from Erwinia chrysanthemi 3937: cloning, expression and characterization. J Biothechnol. 2007; 127:657-669.

2. Aghaiypour K, Wlodawer A, Lubkowski J. Do bacterial L-asparaginase utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu?. J Biochem Biophys Acta . 2001; 1550:117-128.

3. Aghaiypour K, Wlodawer A, Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Er. Chrysanthemi L- asparaginase . J Biochem. 2001; 40: 5655-5664.

4. Huser A, Kloppner U, Rohm K. Cloning, sequence analysis and expression of ansB from Pseudomonas fluorescens, encoding periplasmic glutaminase/asparaginase. FEMS Microbial. 1999; 178:327-335.

5. Kotzia GA, Labrou NE. Cloning, expression and characterization of Erwinia carotovora L-asparaginase. J Biotechnol. 2005; 119: 309-323.

6. Lubkowski J, Palm GJ, Gilliland GL, Derst C, Rohm K, wlodawer A. Crystal structure and aminoacid sequence of wolinella succinogenes L-asparaginase. J  Biochem. 1996; 241:201-207.

7. Harms E, Wehner A, Aung HP, Rohm KH. A catalytic role for threonine-12 of E.coli asparaginaseII as established by site-directed mutagenesis. FEBS.1991; 285: 55-58.

8. Ferrara MA, Severino NMB, Mansure JJ, Martins AS, Oliveira  EMM, Siani AC, Pereira N, Torres FAG, Bon EPS. Asparaginase Production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring saccharomyces cervisiae Asp3 gene . Enz And Microbiol Technol. 2006; 39:1457-1463.

9. Kozak M, Borek D, Janowski R, Jaskolski M. Crystalization and preliminary crystallographic studies of five crystall forms of Escherichia coli L-asparaginaseII (Asp90 Glu mutant). Acta crystallogr D Biol  Crystallogr. 2002; 58:130-132.

10. Ward KR, Adams GDJ, Alpar HO, Irwin WJ. Protection of the enzyme L-asparaginase during lyophilisation–a molecular modelling approach to predict required level of lyoprotectant. J Pharmaceutics. 1999; 187:153-162.

11. Zhang YQ, Zhou WL, Shen WD, Chen YH, Zha XM, Shirai K, Kiguchi K. Synthesis, characterization and immunogenicity of silk fibroin–L-asparaginase bioconjugates. J Biotechnol. 2005; 120:315-326.

12. Maure AM. Therapy of Acute lymphoblastic leukemia in childhood. J Blood. 1980; 56: 1-10.

13. Filupa D, Nagle JW, Pulford S, Anderson DM. Sequence of L-asparaginase gene from Erwinia chrysanthemi NCPPB1125. Nucleic Acid Res. 1988; 16:10385.

14. Ye RW, Tao W, Bedzyk L, Young T, Chen M, Li L. Global gene expression profiles of Bacillus subtilis grownunder anaerobic condition. J Bacteriol. 2002; 182:4458-4465.

15. Minton NP, Bullman  HM, Scawen MD, Atkinson T, Gilbert HJ. Nucleotide sequence of the Erwinia chrysanthemi NCPPB 1066 L-asparaginase gene. J Gen Microbial .1986; 46:25-35.

16. Tilsma H, Bolhuis A, Jongbloed JDH, Brown S, Dijl JM. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. J Microbiol Mol Biol Rev. 2000; 64: 515-547.

17. Maita T, Morokuma K, Mastuda G. Amino acid sequence of L-asparaginase from E.coli. J Biochem. 1974; 76:1351-1354.

18. Perlman D, Halvorson HO. A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukaryotic signal peptides. J Mol Biol. 1983; 167:391-409.

19. Khushoo A, Pal Y, Singh BN, Mukherjee KJ. Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginaseII. protein Exp and purify. 2004; 38:29-36.

20. David T, Bonthron. L-AsparaginaseII of Escherichia coli K-12: cloning, mapping and sequencing of the ansB gene. Gene. 1990; 91:101-105.

21. Sinclair K, warner JP, Bonthron DT. The ASPI gene of saccharomyces cerevisiae, encoding the intracellular isozyme of L-asparaginase. J Gen Microbial. 1994; 144:37-43.

22. Catalog pET system manual (Novagen ) tenth edition ٫ 2002.